Цитогенетичні дослідження - сукупність методів дослідження зв'язку між явищем спадковості і будовою клітин (особливо структур клітинного ядра). Цитогенетичні дослідження відіграють важливу роль в медико-біологічних роботах, так як з їх допомогою з'ясовують генетичні особливості, мінливість (див.), Походження і еволюцію живих істот.
Об'єктом цитогенетичних досліджень служать в першу чергу хромосоми (Див.) Людини, тварин і рослин, що мають специфічні для кожного виду властивості (кількість, розміри, особливості будови) і утворюють характерний для даного організму каріотип. Тому методи цитогенетичних досліджень використовуються при побудові природних класифікацій живих організмів.
У цитогенетичних дослідженнях приділяють особливу увагу полиплоидии - явищу, пов'язаному з кратним збільшенням числа хромосом, що супроводжується появою цілого ряду нових властивостей (збільшення загальних розмірів, смакових якостей фруктів і овочів, життєстійкості у рослин і т. Д.). Розробка проблеми полиплоидии має практичне значення в сільському господарстві, в селекції рослин і тварин.
За допомогою цитогенетичних досліджень виявляють зміни в хромосомах, що передаються потомству і певним чином впливають на ознаки організму. Вивчають шкідливі хромосомні перебудови, втрату, випадання або додавання окремих хромосом або ділянок хромосом. Вони дозволяють виявити участь спадкового чинника у виникненні ряду захворювань людини (див. Спадкові хвороби), в тому числі порушень розвитку, схильність до злоякісних новоутворень і т. Д. Цитогенетичні дослідження привели до правильного розуміння природи променевої хвороби.
За допомогою цитогенетичних досліджень встановлено, наприклад, що в ядрах клітин різних тканин і органів, але тільки у самок, присутні інтенсивно фарбується спеціальними барвниками освіти, так звані тільця Барра або статевий хроматин (Див.). Виявилося, що статевий хроматин зустрічається у багатьох тварин і у людини. Відкриття статевогохроматину дозволило визначати пол людини на клітинному рівні (це має особливе значення для судової медицини), діагностувати підлогу ембріона на ранніх стадіях вагітності і вирішувати ряд інших питань медичної практики.
Див. Також Генетика, Спадковість.
Цитогенетичні дослідження - мікроскопічне вивчення особливих структур клітини, що обумовлюють процеси успадкування та розвитку.
Цитогенетичні дослідження отримують все більш широке застосування в клінічній медицині. Найбільш простим, швидким і доступним методом цитогенетичного аналізу є дослідження статевого хроматину.
Статевий хроматин являє собою хроматиновой тільце, яке відсутнє в особин чоловічої статі, а у особин жіночої статі прилягає до ядерної оболонці.
Таким чином, це тільце може служити цитологічним ознакою статі, у зв'язку з чим воно і отримало назву статевий хроматин.
Розміри тілець статевого хроматину у людини коливаються від 0,7 до 1,2 мк, форма їх може варіювати (рис. 1 - 3). У жінок статевий хроматин визначається в середньому в 40% ядер (рис. 4). Він утворюється однією з Х-хромосом жіночого каріотипу, що знаходиться в неактивному, спирализованную стані. Статевий хроматин можна визначити в клітинах слизової оболонки порожнини рота, піхви і сечівника, а також у клітинах крові, біопсірованной шкіри, культивованої тканини дорослого, в ембріональної тканини, нервових клітинах.
Найбільш проста і зручна методика визначення статевого хроматину в клітинах слизової оболонки порожнини рота запропонована Тірі (Н. Thiries) і вдосконалена Сандерсон (S. Sanderson). Для дослідження беруть зішкріб зі слизової оболонки щік. Матеріал переносять на предметне скло, висушують на повітрі і протягом 10 хв. фіксують в метиловий спирт. Фарбування роблять краплею свежефільтрованного ацетоорсеіна (1 г синтетичного орсеїном розчиняють в 45 мл крижаної оцтової кислоти, підігрівають до кипіння і після охолодження фільтрують, до 45 мл профільтрованого розчину додають 55 мл дистильованої води і цю суміш фільтрують повторно). При мікроскопірованіі іммерсійним об'єктивом підраховують кількість хроматінположітельних ядер на 100 клітин.
Дослідження статевого хроматину застосовують для цитологічного визначення статі, швидкої та ранньої діагностики захворювань, пов'язаних з абераціями статевих хромосом (зокрема, синдромів Клайнфелтера, Шерешевського-Тернера та ін.), Характеристики ряду фізіологічних процесів (зокрема, менструального циклу), дослідження загальних і локальних закономірностей ряду патологічних процесів і насамперед злоякісних новоутворень, з'ясування дії деяких терапевтичних методів і засобів (антибіотиків, кортикостероїдів, цитостатичних препаратів).
До методів цитогенетичного аналізу відноситься також вивчення каріотипу (див.).
Встановлено, що хромосомний набір людини складається з 46 хромосом (23 пари), двох статевих хромосом (XX - у жінки, XY - у чоловіка), 22 пар аутосом (рис. 5) і відрізняється високою постійністю в клітинах людського організму.
Залежно від довжини хромосом і розташування їх центромер весь хромосомний набір ділиться на 7 груп - А, В, С, D, Е, F, G.
Для вивчення хромосомного набору людини (каріотипу) використовують методи культивування лейкоцитів периферичної крові, фібробластів ембріональної тканини, культивування клітин шкіри і прямий метод визначення хромосомного набору в клітинах кісткового мозку.
Вперше про успішне культивуванні неделящіхся лейкоцитів повідомив радянський біолог Г. К. Хрущов (1935). У 1958 р Ноуелл (P. Nowell) запропонував використовувати для стимуляції ділення лейкоцитів речовина, виділена з бобових рослин, - фитогемагглютинин (ФГА). Культивування лейкоцитів здійснюють за модифікованою і вдосконаленою методикою. 10 мл венозної крові, взятої стерильно в пробірку з гепарином (1 мл ампулированного гепарину розводять у 20 разів розчином Хенкса), поміщають на 30-40 хв. в холодильник. Потім стерильно (в боксі) в кров додають 0,7 - 1 мл 10% розчину желатини для прискорення осадження еритроцитів. Після відстоювання крові плазму відсмоктують і поміщають в стерильну колбу. До плазмі додають середу 199 або середу Голка з розрахунку 1,5 мл середовища на 1 мл плазми.
Для стимуляції мітотичної активності лейкоцитів у суміш додають 0,2 мл ФГА. Отриману клітинну суспензію поміщають в термостат при t ° 37 ° на 72 години. За 2-3 години до проведення фіксації на кожен флакон (суспензія для культивування розливається по 1,5-2 мл в стерильні флакони типу пеніцилінових) додають по 0,5-0,75 мкг колхіцину (робочий розчин колхіцину: 10 мкг на 1 мл дистильованої води) і продовжують культивування. Надалі культури центрифугують протягом 5 хв. при 800 об / хв. Надосадову рідину зливають, до неї додають 3-5 мл 0,95% розчину цитрату натрію, нагрітого до t ° 37 °, який викликає набухання клітин. У гіпотонічному розчині клітини знаходяться від 15 до 30 хв., Після чого надосадову рідину зливають, до осаду обережно додають фіксатор (3 ч. Абсолютного спирту + 1 ч. Крижаної оцтової кислоти), ставлять у холодильник на 15 хв., Потім повторно центрифугують і змінюють фіксатор. На знежирені предметні скельця наносять 1-2 краплі клітинної суспензії і висушують над полум'ям або підпалюють фіксатор («палені» препарати). Препарати фарбують поліхромної синню Унни, ацетоорсеіном або за Романовським. Хромосомний набір вивчають за допомогою імерсійної мікроскопії в 100 метафазних пластинах.
Для вивчення хромосом використовують також прямий метод визначення хромосомного набору в клітинах кісткового мозку: 1 мл свежеаспірірованного пунктата кісткового мозку поміщають в колбу з 30 мл середовища 199 і 3 мл розчину колхіцину (10 мкг на 1 мл). Вміст колби обережно збовтують для рівномірного розподілу клітин, а потім центрифугують. Надосадову рідину зливають і до осаду додають 10 мл 0,95% розчину цитрату натрію, підігрітого до t ° 37 °. Клітини ретельно ресуспензіруют і поміщають в термостат при t ° 37 ° на 40-45 хв. Після цього знову проводять центрифугування, надосадову рідину зливають і до осаду додають свіжоприготований фіксатор, що складається з 3 ч. Метилового спирту і 1 ч. Концентрованої оцтової кислоти. Через 10 хв. осад ресуспензіруют і залишають у фіксаторі ще на 20 хв. при кімнатній температурі, потім центрифугують протягом 10 хв., знову змінюють фіксатор і готують препарати тим же способом, як при фіксації культури лейкоцитів крові.
Дослідження каріотипу може бути з успіхом використано для діагностики хромосомних захворювань людини. За останній час виділена ціла група хромосомних хвороб, пов'язаних з патологією як статевих, так і аутосомних хромосом (див. Спадкові хвороби). Крім зміни кількості хромосом, можливе порушення їх морфології. Так, при хронічний мієлоїдний лейкоз спостерігається незвично мала акроцентріческіе хромосома з 21-ї пари. Поява анеуплоїдії (збільшення або зменшення числа хромосом, некратні гаплоидному числу хромосом) може служити прогностичним тестом для термінальній стадії лейкозу.
Цитогенетичні дослідження все ближче сходяться з онкологічними. Можливо, що зміни хромосомного набору при ракових процесах можна буде використовувати для їх ранньої діагностики. Для цитогенетичних досліджень використовують методи короткочасних тканинних культур: метод плазмового згустку з подальшим дослідженням субкультур і метод первинно трипсінізірована суспензійних культур. Перевагу слід віддати першому методу, так як другий вимагає великої кількості тканини для отримання суспензії клітин, здатних до розмноження.
Для створення найбільш сприятливих умов метаболізму використовують плацентарну сироватку людини, яка не володіє токсичністю, 50% ембріональний екстракт абортованих плодів людини, який готують на середовищі Голка. Для закріплення шматочків на склі та прикріплення більшої кількості клітин при застосуванні суспензійних культур використовують суху людську плазму IV групи, розведену перед вживанням середовищем Голка і плацентарної сироваткою 1: 1 після внесення експлантатов додають ембріональний екстракт. Культивування проводять у флаконах Карреля (див. Культура тканин).
Рис. 1. Статевий хроматин у вигляді овалу (Х1100).
Рис. 2. Статевий хроматин у вигляді трикутника (XI100).
Рис. 3. Статевий хроматин у вигляді потовщення ядерної оболонки (Х1100).
Рис. 4. Хроматінотріцательное ядро у жінки (Х1100).
Рис. 5. Нормальний жіночий каріотип (x1100).