Більшість методів зводиться до випробування дії розчиненого ферменту на субстрат при стандартизованих умовах. Продукти реакції можна визначати хімічним, манометричним, спектрофотометрическим, потенциометрическим, полярографическим, флуоресцентним або радіохімічного методами.
Кількість ферменту вказують в одиницях, які для деяких ферментів затверджені в міжнародному масштабі. На жаль, у ряді випадків для одного і того ж ферменту запропоновано багато різних одиниць залежно від методу визначення. Багато авторів користуються власними методами і стандартами, що призводить до плутанини. Точне порівняння різних одиниць і переклад одних одиниць в інші неможливі.
Для того щоб уникнути плутанини, Комісія з ферментам Міжнародного біохімічного союзу і секція клінічної хімії Міжнародного союзу теоретичної і прикладної хімії в 1959 р прийняли нову стандартну одиницю активності ферменту. Ця одиниця визначається як кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв при 25 ° С в оптимальних умовах концентрації субстрату, рН та іонної сили буферних систем. Питома активність визначається як активність 1 мг даного ферменту. Ферменти можна також виявляти (і оцінювати кількісно) в зрізах тканин (гістохімічні методи).
Визначення активності ферментів має велике значення в діагностиці захворювань і при спостереженні за перебігом хвороби. У більшості випадків ферменти діють тільки на один компонент рацемічних речовин - зазвичай на той, який зустрічається в природі. Ця специфічність важлива для стереохімії, оскільки вона дає можливість розділяти рацемати на оптичні антиподи.