Електрофорез - це рух заряджених частинок під дією електричного поля. Оскільки різні частинки можуть володіти різними величинами зарядів і відчувати при русі неоднакове опір середовища, швидкість їх переміщення може бути різною. На цьому принципі і грунтується застосування електрофорезу в якості методу розділення речовин.
З початку 50-х років почалося широке поширення методу електрофорезу спочатку на папері, а потім послідовно на інших підтримуючих середовищах і в гелях.
В даний час завдяки високій ефективності поділу, широких можливостей застосування, а також простоті і дешевизні використовуваної апаратури методи препаративного і аналітичного електрофорезу знаходять дуже широке застосування в біології та медицині для виділення і дослідження властивостей, головним чином високомолекулярних біополімерів - білків, протеидов, поліпептидів і нуклеїнових кислот.
Білки і нуклеїнові кислоти є амфотерними електролітами і містять здатні до іонізації як кислотні, так і основні групи, ступінь іонізації яких, природно, залежить від рН середовища. Загальний заряд молекули визначається сумою розташованих на її поверхні позитивних і негативних зарядів. Якщо ця сума дорівнює нулю, молекула не буде рухатися під дією електричного поля. Значення рН розчину певного складу, в якому ця речовина не переміщується в електричному полі, називається ізоелектричної точкою даної речовини. Ізоелектрична точка є важливою характеристичної константою білків. При рН середовища вище ізоелектричної точки сумарний заряд молекули стає негативним і вона буде рухатися у напрямку до анода. При рН нижче ізоелектричної точки молекула рухається до катода.
Для розуміння природи електрофоретичної рухливості важливо уявляти собі, що електрофорез завжди проводиться в буфері, т. Е. В розчині електроліту. У цих умовах кожен заряд екранований дифузної оболонкою противоионов. Відповідно до теорії Дебая-Хюккеля товщина цієї оболонки залежить від іонної сили розчину. У вельми розведених розчинах при іонної силі нмlt; 0,01 її товщина перевищує розміри білкової молекули і тоді електрофоретична рухливість залежить від сумарного заряду і радіуса білкової молекули, т. Е. Залежить від кореня кубічного з молекулярного ваги. У концентрованих сольових розчинах при нмgt; 0,1, в яких практично і проводиться електрофорез, дебаєвсьного оболонка стає менше 10 А (1 нм), т. Е. Менше розмірів білкової молекули. При цьому створюються умови при яких електрофоретична рухливість білків абсолютно не залежить від їх молекулярних ваг. Цей надзвичайно важливий висновок справедливий для всіх видів електрофорезу за винятком електрофорезу в гелях, що володіють ефектом молекулярного сита (ссфадекс, поліакриламід, т. Е. Поєднання електрофорезу з гельфільтрадіей, і випадків застосування спеціальних прийомів, наприклад проведення електрофорезу в присутності іонів додецилсульфата).
Електрофоретична рухливість спрощено можна описати наступним виразом:
U = S / E · t
де U - рухливість частинки в см2ХВ-1Хс-1-
S - пройдений частинкою шлях в см-
Е - напруженість електричного поля в В / см-
t - час у секундах, за яке частинкою був пройдений шлях 5.
Рухливість білків лежить в межах (0,1-1,0) X10-4 см2Х B-1Xc-1.
Розрізняють два принципово відмінних способу проведення електрофорезу. Це фронтальний електрофорез або електрофорез з рухомою границею, званий іноді електрофорезом в вільному середовищі по Тізеліус, і зональний електрофорез [28].
Метод фронтального електрофорезу має низку серйозних недоліків, в даний час повністю витіснено з ужитку різними видами зонального електрофорезу на підтримуючих середовищах.
Ідея зонального електрофорезу полягає в тому, що розчин досліджуваної суміші речовин вводиться в середу, що містить електроліт, у вигляді дуже вузької зони. За рахунок відмінностей у електрофоретичної рухливості окремих складових суміші вони поділяються також у вигляді вузьких зон. Зрозуміло, що в цьому випадку роздільна сила методу буде тим вище, чим вже нанесена вихідна зона і чим нижче швидкості поступальної дифузії молекул поділюваних речовин. Вельми важливою вимогою стабілізації зон є проведення поділу в умовах, що виключають виникнення конвекції.
В якості підтримують середовищ для зонального електрофорезу були використані папір, порошки скла, целюлози і крохмалю, плівки з ацетилцелюлози, а також крохмальний, агаровий, агарозного, поліакріламідний та інші гелі. Застосування гелів завдяки поєднанню електрофорезу з ефектом гельфильтрации, чутливим до величин молекулярних ваг, призвело до суттєвого підвищення роздільної сили методу. Ще більшого збільшення ефективності фракціонування сумішей речовин вдалося домогтися послідовним поєднанням методу електрофорезу з хроматографією (двовимірний електрофорез) і з іммунопреціпітаціі (іммуноелектрофорез).
Раніше інших видів зонального електрофорезу був запропонований електрофорез на папері, що отримав надзвичайно широке поширення не тільки в науково-дослідних, але і клінічних лабораторіях, і не втратив свого значення і зараз незважаючи на появу ряду нових методів, що володіють більш високою роздільною здатністю.
Принцип аналітичного варіанта електрофорезу на папері полягає в тому, що на смужки фільтрувального паперу шириною 1-3 см, просочені буферним розчином, вузькою смугою наносять досліджувану суміш білків або сироватку крові в кількості не більше 5 мкл на 1 см ширини паперу і до кінців паперу прикладають напругу постійного струму. У подальшому розділились зони речовин забарвлюють, ідентифікують і проводять кількісне визначення. Відомо безліч конструкцій апаратів для аналітичного електрофорезу на папері. Багато хто з них виробляються як у нас в країні, так і зарубіжними фірмами.
Для проведення електрофорезу на папері в рівній мірі придатні обидва типи випускається в СРСР хроматографічного паперу марок Б (швидка) і М (повільна). Рекомендується кожну серію експериментів проводити на папері однієї партії. З імпортних паперів найбільш популярні паперу фірми «Ватман» (Англія). Хороші результати можна отримувати на паперах Ватман № 1, 2 і ЗММ.
Нанесення на папір вузької смуги проби можна виробляти швидким штрихом микропипетки з заокругленим або плоским кінцем, що, однак, вимагає певної вправності і не завжди дає відтворювані результати. Краще це робити шляхом дотику до паперу ребра покривного скла, за яким була розмазана крапля досліджуваної проби. Ще краще виготовити нескладне пристосування (рис. 102), в якому проба наноситься між двома тонкими (00,1 - 0,2 мм) паралельно розташованими на відстані приблизно 0,5 мм тяганиною з нержавіючої сталі або ніхрому. Тримач встановлюється в необхідному положенні над вологим папером, після чого натисканням кнопки проводиться опускання дротяної рамки до торкання її з папером.
Рис. 102. Пристосування для нанесення проби на папір.
Для усунення впливу на поділ продуктів електролізу та зміни рН буферів в електродних судинах найбільшого поширення набула лабіринтова система. Електричний контакт між електродним посудиною досить великого обсягу і проміжним посудиною здійснюється за допомогою просочених буфером їнотів з паперу або азбестового шнура, а також заповнених буфером V-образних трубок з кінцями, закритими скляній або звичайної ватою. Більш ефективно, але й більш громіздко застосування безперервного протоку буферного розчину через електродні судини самопливом або за допомогою циркуляційного насоса з наступним об'єднанням порцій буфера, що пройшли через анодний і катодний судини. При цьому можливе багаторазове використання одного і того ж буфера. Цей метод частіше застосовується в препаративних варіантах електрофорезу.
Як електроди переважно всього користуватися платинової дротом O 0,3-0,8 мм. Хлоросрібні насичені електроди (срібна дріт, покрита шаром хлору методом електролізу) необхідно від досвіду до досвіду використовувати поперемінно в якості анода або катода.
Важливою умовою отримання чіткого поділу зон є запобігання або максимальне зниження випаровування рідини з поверхні паперу. Випаровування призводить, по-перше, до підвищення в папері концентрації солей, а отже, зниженню її електричного опору і, по-друге, до безперервного надходженню в папір рідини з електродних судин (реофорез), що викликає зсув білкових зон. При використанні невисоких градієнтів напруги порядку 2-5 В / см нагрів смужок паперу не дуже великий і для зниження випаровування досить проводити електрофорез у вологій камері. Тому камера для електрофорезу повинна бути герметичною і, можливо, меншого обсягу, щоб стан насичення водяними парами відбувалося швидко. Кришка камери повинна бути злегка закругленою або похилій, щоб конденсуються на ній краплі води стікали по стінках, а не падали на папір. Форма камери може допускати вертикальне, похиле, П-образне, у вигляді перевернутої букви V або горизонтальне положення паперу. Застосування вертикального або похилого положення паперу зазвичай пов'язане з бажанням зменшити габарити приладу. Практика показала, що при горизонтальному положенні паперу, що лежить на гострих виступах дна камери, щоб уникнути затікання під неї рідини вдається домогтися мінімального обсягу камери і створити найкращі умови для поділу.
Вітчизняна промисловість випускає ряд моделей приладів для аналітичного електрофорезу на папері. У лабораторіях застосовується також апаратура, що випускалася раніше, надалі знята з виробництва.