Більшість джерел світла, що існують у природі, є температурними.
Багато речовин, нагріті до певної температури, випромінюють світло. Люмінесценція - особливий вид світіння речовини, яка за рідкісним винятком не супроводжується підвищенням його температури.
Існує кілька видів люмінесценції, що класифікуються залежно від методу збудження молекул речовини.
Фотолюмінесценція - світіння речовини, що викликається променистою енергією, що падає на люминесцируют тіло.
Хемілюмінесценція - світіння, що викликається енергією, що утворюється при хімічної реакції.
Електролюмінесценція виникає під дією електричного розряду. Найчастіше спостерігається при проходженні електричного струму через розріджений газ.
Рентгенолюмінесценція - світіння, що виникає під дією рентгенових променів.
Катодолюмінесценція - світіння речовини, що знаходиться під впливом потоку електронів.
Тріболюмінесценціей - люмінесценція, що викликається тертям.
Люмінесценцію поділяють ще по тривалості свічення - на флуоресценцію і фосфоресценцію.
Флуоресценція - це світіння, що виникає миттєво, в момент порушення молекул речовини. З видаленням джерела порушення світіння припиняється.
Фосфоресценція - тривале світіння тіл, що акумулюють енергію і испускающих світіння тривалий час і після видалення джерела збудження.
Фізичний зміст явища флуоресценції полягає в наступному. При поглинанні ультрафіолетової променевої енергії молекули речовини переходять в «порушену» стан, при якому електрони перебувають на більш високих енергетичних рівнях. Збуджена молекула не може довго зберігати надлишок енергії і повертається в нормальний стан шляхом випромінювання надлишку енергії у вигляді перетвореної променевої енергії - флуоресценції.
Як правило, спектр флуоресценції зміщений у порівнянні зі спектром поглинання збуджуючого світла в бік більш довгих хвиль (правило Стокса) [8], що пов'язано з перерозподілом енергетичних рівнів молекул і зменшенням енергії кванта, випромінюваного речовиною, в порівнянні з квантом поглинається світла.
Існує кілька видів люмінесцентного аналізу: люмінометріческій кількісний аналіз (флуориметр), сортовий і якісний аналіз, люмінесцентна мікроскопія, флуоріметріческой титрування із застосуванням флуоресцентних індикаторів, люмінесцентна хроматографія та ін.
В аналітичній практиці кількісного аналізу найбільш широке застосування отримала фотолюмінісценція (флуориметр), демонстрована здебільшого в ультрафіолетовому світлі. Цей вид аналізу заснований на залежності, в певних умовах, між інтенсивністю люмінесценції і концентрацією аналізованого речовини [30].
Отримання правильних результатів обумовлено обов'язковим урахуванням ряду чинників, що заважають, що є специфічними для цього виду аналізу. Чутливість флуоріметріческой видів аналізу значно вище абсорбціометріческіх і часто вплив мікродомішок в реактивах сильно спотворює результати дослідження. Ця висока чутливість викликає необхідність застосування реактивів особливої чистоти або хімічно чистих.
Флуоресцентний аналіз використовується для виявлення та ідентифікації речовин. Основою для цього дослідження є правило, згідно з яким спектр флуоресценції є характерним для даної речовини і не залежить від довжини хвилі збуджуючого світла. Таким чином, випромінювання має завжди однаковий спектральний склад за досить рідкісним винятком. Ця властивість використовується в тих випадках, коли потрібно встановити присутність шуканого речовини, вивчити хімічні зміни, зазнає цією речовиною, а також визначити його кількість.
Переваги люмінесцентного аналізу в порівнянні з іншими методами аналізу не обмежуються високою чутливістю, що дозволяє виявляти стомільярдну частки грама вихідної речовини [35]. Цей вид аналізу щодо простий, дозволяє досить швидко отримувати результати, внаслідок чого він може бути зарахований до експресним видам аналізу.
Є ряд факторів і закономірностей, що впливають на флуоресценцію речовин в розчині [30]. Встановлено, що залежність інтенсивності флуоресценції розчину від концентрації флуоресціюючого речовини має межу. Це відбувається внаслідок «гасіння» флуоресценції молекулами самого флуоресціюючого речовини, що настає у більшості флуоресціюючих речовин уже в концентрації 10-4 г / мл і вище.
При збільшенні концентрації вище цих меж інтенсивність світіння не тільки повільно зростає, але навіть може знижуватися. Тому слід працювати з розчинами більш низької концентрації флуоресціюючого речовини, порядку 10-6?10-7 г / мл і нижче.
Відомо, що гранична концентрація, до значення якої зберігається пропорційність флуоресценції, для різних речовин різна. Тому необхідно попереднє побудова калібрувальної кривої за стандартними розчинів. Таким шляхом для кожної речовини експериментально визначається область концентрацій, придатних для вимірювання.
Важливим фактором, що впливає на інтенсивність флуоресценції, є рН розчинів. При цьому може змінюватися не тільки інтенсивність флуоресценції, але і її колір (спектр). Наприклад, розчин акридину однаковій концентрації, в кислому середовищі дає зелену флуоресценцію, в лужному - ліловий, що пов'язано з тим, що в кислому середовищі флуоресціює іон акридину, а в лужному - недіссоціірованних підставу. Таким чином, речовини, молекули яких здатні різному диссоциировать в кислих і лужних середовищах, мають досліджуватися при певній і однаковою концентрації водневих іонів.
Зниження флуоресценції або «гасіння» може обумовлюватися не тільки молекулами флуоресціюючого речовини, але й іншими неорганічними або органічними компонентами, наприклад йодистого калію, хромистого натрію та ін.
Однією з закономірностей люмінесценції, встановленої С. І. Вавілов, є залежність енергетичного виходу люмінесценції від довжини хвилі збуджуючого світла, так званий квантовий вихід, який являє собою відношення випромінюваної речовиною енергії люмінесценції до поглиненої енергії збудження [30].
Квантовий вихід зберігається постійним аж до деякого значення, характерного для кожної речовини, після чого різко падає. Відповідно до цієї закономірності спектр люмінесценції не залежить від довжини хвилі збуджуючого світла.
Квантовий вихід має значення при оцінці чутливості аналізу і при знятті характеристичних спектрів речовини.
При роботі з флуометр необхідно враховувати наступне:
1. Для речовин, молекули яких дисоціюють різному в різних середовищах, потрібно дотримуватися однакову величину рН в досліджуваних і стандартних розчинах.
2. При дослідженнях необхідно проявляти Певну ретельність, так як на посуді або на руках можуть виявитися сліди флуоресціюючих речовин, які при попаданні в розчин можуть спотворити його флуоресценцію. Деякі миючі засоби володіють значною флуоресценцією і не видаляються при обполіскуванні.
3. При користуванні газорозрядними лампами потрібно дотримувати необхідні заходи. Колби ламп високого і надвисокого тиску нагріваються до 700 ° С. Тому лампи цього типу поміщені в арматуру і їх слід встановлювати, як вказано в інструкції. Для повітряного охолодження лампи є вентиляційні отвори і під час роботи лампу не слід знімати і відкривати. Повторне запалювання лампи після виключення можливе лише після її охолодження.
Прилади для флуоресцентного аналізу містять такі основні елементи або вузли:
а) джерело ультрафіолетового випромінювання для порушення флуоресценціі-
б) первинні світлофільтри або монохроматор для виділення монохроматичного ділянки спектру возбужденія-
в) кювети-
г) вторинні світлофільтри для виділення флуоресценціі-
д) приймач випромінювання (з підсилювальним пристроєм) і вимірювальний прилад.
Найбільш широке застосування в якості джерела ультрафіолетового випромінювання отримали ртутно-кварцові лампи. При певному напруженні, доданому до електродів лампи, виникає електричний розряд в парах ртуті. Розрізняють ртутні лампи низького, високого та надвисокого тиску. Застосовуються також ртутно-кварцові лампи газового дугового розряду типу ДРШ, які володіють великими густиною випромінювання, газонаповнені імпульсні лампи, ксенонові лампи високого тиску.
Ртутно-кварцові лампи надвисокого тиску є концентрованими джерелами ультрафіолетового світла. Така лампа з повітряним охолодженням, наприклад СВД-120А, дає високу яскравість випромінювання на невеликій ділянці. Лампа споживає потужність в 120 Вт Усередині кварцовою трубки знаходяться пари ртуті, які при роботі лампи створюють тиск близько 50 атм. Цей тип лампи широко застосовується у вітчизняних приладах.
Ксенонові лампи високого тиску випромінюють неперервний спектр широкого діапазону і високої інтенсивності. Ці лампи придатні як для приладів кількісного аналізу, т. Е. Для оцінки інтенсивності флуоресценції, так і для зняття спектрів збудження.
Оскільки інтенсивність флуоресценції залежить від інтенсивності збуджуючого світла, то збільшення чутливості приладу пов'язане з використанням джерел світла великої яскравості. Однак багато флуоресцирующие речовини, особливо в сильно розбавленому вигляді, піддаючись сильному опроміненню, поглинають його і при цьому руйнуються, що спотворює результати дослідження. Має місце так зване фоторазрушеніе. Щоб уникнути цього, в багатьох приладах утримуються від застосування сильних джерел світла, віддаючи перевагу підвищувати чутливість приладу за рахунок збільшення чутливості приймачів світла. Для цієї ж мети, т. Е. Зменшення фоторазрушеніі, в приладах встановлюються шторки для відкривання джерела світла тільки на час вимірювання.
Для виділення певних ділянок ультрафіолетового випромінювання застосовуються світлофільтри як з кольорового оптичного скла, так і інтерференційні. Зазвичай для люмінесцентного аналізу використовуються наступні марки: УФС-1 (область 240-400 нм) - УФС-2 (область 270-380 нм) - УФС-6 (область 320-390 нм).
В якості виборчих фільтрів з кольорового скла застосовуються також ФС-1, ФС-6 (фіолетові), СС4, СС5, СС8, СС14 (сині) і синьо-зелені (СЗС5, СЗС7, СЗС8 та ін.).
Замикаючі або заграждающие світлофільтри повинні, навпаки, не пропускати, а поглинати небажану область випромінювання. Вони служать для гасіння збуджуючого світла при вимірюванні флуоресценції. Так, наприклад, для гасіння ультрафіолетового світла застосовуються світлофільтри з жовтого скла ЖС-4, ЖС-11 та ін. [16].
У багатьох випадках необхідні інтерференційні світлофільтри, які дозволяють виділяти більш вузькі ділянки спектра збудження. В останні роки такі фільтри все частіше використовуються при конструюванні флуориметра.
Кращими пристроями для виділення вузьких спектральних інтервалів є монохроматори. Монохроматори можуть застосовуватися для виділення ділянок спектрів збудження і флуоресценції. Монохроматори складні і відносно дорогі, щоб їх можна було застосовувати замість фільтрів. Їх використовують головним чином при конструюванні складних приладів, Спектрофлуориметр і спектрофотометрів. Як приймач випромінювання під флуориметр застосовуються головним чином фотоелектронні помножувачі (ФЕУ). Коефіцієнт посилення цих електровакуумних приладів сягає від 105 до 107. Особливо важливо таке посилення у випадках, коли мають справу з дуже слабкими випромінюваннями.
У фотопомножувачів застосовуються такі ж фотокатоди, як і в фотоелементах і, таким чином, все сказане про фотокатодів залишається в силі і для ФЕУ [30].
Принцип дії ФЕУ та схема включення показані на рис. 81. У фотоумножителе є фотокатод, ряд каскадів підсилення (дінодов), до кожного з яких докладено прискорює напруга і анод.
Рис. 81. Схема включення фотоумножителя.
К - фотокатод- Д1,2,3 - діноди- G - мікроамперметр- R - ділянки подільника напруги.
Світловий потік потрапляє на фотокатод К через скло балона або через кварцове вікно. Кванти світла вибивають з фотокатода електрони, які рухаються під дією прикладеної напруги на перший каскад посилення (динод) Д. Кожен електрон вибиває з динода кілька нових електронів. Знову утворилися електрони направляються до наступного дінодов Д, де число електронів знову зростає в кілька разів, і так до останнього динода. Весь помножений потік електронів потрапляє на анод, і таким чином ланцюг замикається і по ній починає протікати струм, реєстрований мікроамперметром G. Звичайно число дінодов, що містяться в ФЕУ, становить від 8 до 14. R - ділянки подільника напруги.
Найважливішими параметрами ФЕУ є: чутливість фотокатода, спектральна чутливість, довговічність, анодная чутливість, темновой струм, поріг чутливості, лінійність.
Для вимірювання флуоресценції в приладах застосовуються три основні види оптичних схем: 1) для вимірювання флуоресценції в світлі, 2) для вимірювання флуоресценції під кутом 90 °, 3) для вимірювання флуоресценції з поверхні збудження.
На рис. 82 зображена спрощена оптична схема для вимірювання флуоресценції в прохідному світлі. Світло джерела випромінювання 1 проходить первинний світлофільтр 2, який виділяє монохроматичне світло для порушення флуоресценції. Це монохроматичне випромінювання падає на кювету 5 з розчином. Що виникає в розчині випромінювання флуоресценції проходить через вторинний світлофільтр 3, надходить на фотоприймач 4 та реєструється мікроамперметром. Перша схема застосовується в тих випадках, коли в приладі використовуються досить довгі кювети. При цьому практично всі збудливу випромінювання поглинається в кюветі. Недолік цієї схеми виявляється в тому, що в певних умовах (довжина кювети, поглинаючі властивості розчину) флуоресценція може поглинатися або послаблюватися в самій кюветі.
Рис. 82. Оптична схема для вимірювання флуоресценції в прохідному світлі.
Пояснення в тексті.
Рис. 83. Оптична схема для вимірювання флуоресценції під кутом 90 °.
1 - джерело ізлученія- 2 - первинний светофільтр- 3 - кювета з раствором- 4 - вторинний светофільтр- 5 - фотоприймач.
Для усунення цього недоліку застосовується схема вимірювання флуоресценції під кутом 90 ° до осі збудливого випромінювання. Схема показана на рис. 83, а я б.
Переваги вимірювання під кутом 90 ° наступні:
а) кювету може бути значно коротше і меншою емкості-
б) вторинний світлофільтр можна ставити з меншою ізбірательностью-
в) для порушення флуоресценції може бути використаний більш широкий спектр, що веде до збільшення чутливості всієї системи.
Третій варіант оптичної схеми застосовується при конструюванні приладів, призначених для вимірювання флуоресценції розчинів, сильно поглинаючих випромінювання.
На рис. 84 зображена принципова оптична схема для вимірювання флуоресценції з поверхні збудження. Світло джерела порушення 1 проходить, первинний світлофільтр 2, напівпрозоре дзеркало 3 і падає на кювету. Флуоресценція розчину з того ж боку кювети потрапляє на дзеркало, відбивається і надходить через вторинний світлофільтр 4 на фотоприймач 5.
У цьому варіанті оптичної схеми товщина шару розчину може бути ще зменшена в порівнянні з попередніми.
Рис. 84. Оптична схема для вимірювання флуоресценції з поверхні збудження. Пояснення в тексті.