Фотометричні і спектрофотометричні методи набули широкого поширення в лабораторіях. Ці методи дозволяють відносно швидко визначати вельми малі кількості речовин. Відрізняючись простотою, гарною чутливістю і високою швидкістю аналізу, вони знаходять застосування як в повсякденній практиці, так і в дослідницькій роботі. Фотометричний аналіз є одним з найбільш зручних методів визначення малих кількостей речовини, так як існує практично необмежена можливість перетворення речовини в розчин, сильно поглинає світло [3].
Є певна закономірність у поглинанні частини світлового спектру пофарбованим розчином. Наприклад, розчин, забарвлений в жовтий колір, поглинає синю частину світу, т. Е. Додатковий колір.
Величина светопоглощения в фотометрії виражається величиною оптичної щільності D (екстинкція або поглинання розчину іноді позначається Е). Величина, зворотна щільності, називається прозорістю, або пропусканням розчину, позначається Т і виражається у відсотках.
Основним законом колориметрії і абсорбціометріі є об'єднаний закон Вугера - Ламберта - Віра. З цього закону випливає, що оптична щільність розчину, або екстинкція, прямо пропорційна концентрації поглинаючої речовини, товщині шару розчину і молярному коефіцієнту погашення. Закон має наступний вираз
D = Е = ?? Сl, де D - щільність або Е - екстінкція-
?? - Молярний коефіцієнт погашенія-
С - концентрація речовини, що поглинає світло-
l - товщина поглинаючого шару забарвленого розчину.
Молярний коефіцієнт погашення являє собою оптичну щільність 1М розчину, поміщеного в кювету з товщиною шару 1 см. Він дозволяє об'єктивно оцінити чутливість реакції. Так, наприклад, для слабоокрашенних речовин, таких, як хромат калію, молярний коефіцієнт погашення становить 400-500, а для дитизонати міді - близько 50 000. Звідси випливає висновок, що друге речовина перевершує по чутливості перший приблизно в 100 разів [39].
Не всяка концентрація розчину може бути використана для фотометричних визначень. Оптимальними межами вимірювань на фотоелектричних приладах вважаються розчини, що поглинають від 5 до 90% світла [8], що відповідає від 0,02 до 1,0 оптичної щільності. Для фотоелектричних приладів, забезпечених підсилювачами і відповідним запасом по чутливості, ця межа може бути підвищений до оптичної щільності 2,0. Звідси, власне, виходять деякі рекомендації при вимірах: а) якщо щільність розчину велика, то необхідно розбавити розчин або взяти кювету з більш тонким слоем- б) у разі малої щільності розчину потрібно переходити на кювету з більшою товщиною робочого шару.
Основний закон фотометрії дотримується в суворо визначених умовах. На практиці є обмеження, причиною яких є відхилення від цього закону, викликані деформацією молекул, недостатньою монохроматичністю світла, зміною ступеня дисоціації іонів та іншими причинами.
При дотриманні основного закону фотометрії графік залежності між концентрацією забарвленого розчину і його оптичною щільністю виражається прямою лінією. При порушенні закону пропорційність спотворюється (рис. 66).
Рис. 66. Залежність оптичної щільності від концентрації. 1 - при дотриманні основного закону фотоколоріметріі- 2 - при його порушенні. Пояснення в тексті.
Переходячи до опису властивостей і особливостей окремих типів приладів для фотометричного аналізу, необхідно відзначити деякі досягнення та удосконалення в їх пристрої, що відображають прогрес у науці і техніці.
У практиці зарубіжних лабораторій набули широкого поширення гемоглобінометри, цукрометри, Білірубінометри, прилади для визначення насичення крові киснем, засновані на фотометрическом методі вимірювання.
У зв'язку із збільшеним об'ємом роботи лабораторій, а також з великим прогресом у техніці автоматичного аналізу з'явилися різні автоматизовані фотоколориметри і автоматичні аналізатори, забезпечені як вимірювального приладу фотоелектричним колориметром або спектрофотометром. Цікаво відзначити, що 70% відомих аналізаторів забезпечені не спектрофотометрами, а більш простими фотоколориметрія [22].
Застосування волоконної оптики в фотоколориметр дозволило створити проточну кювету, в якій об'єм розчину становить 0,002 мл [87].
В останні роки в якості джерела випромінювання в фотоелектричних пристроях використовуються оптичні квантові генератори (лазери). Лазери виявилися вельми перспективними тому, що їх випромінювання має властивість монохроматичности і спрямованості більш високої якості, ніж одержуване після кращих інтерференційних фільтрів [56]. Розроблено і вже випускаються спектрофотометри з використанням лазера в якості джерела світла.
Складність приладів для фотометричного аналізу зростає з переходом від візуальних фотометров до фотоелектричним і далі до спектрофотометра. У візуальних фотометрах використовується принцип зрівнювання освітленостей під контролем ока. Більш досконалими є фотоелектричні прилади. Вони мають ряд переваг перед візуальними фотометрами: а) виключається стомлюваність очі при масових аналізах, зникає суб'єктивна помилка при ізмереніях- б) фототок, що виникає при потраплянні світла на фотоелемент, вимірюється стрілочними або іншого роду приладами і може бути виміряний набагато точніше, ніж при візуальному визначенні освітленості, що в підсумку підвищує точність аналізу-в) фотоелектроколориметр в принципі дозволяє проводити дослідження не тільки у видимій області світла.
У лабораторіях медичних установ набули широкого поширення фотоелектричні колориметри типів ФЕК. Спочатку випускалися колориметри ФЕК-М, ФЕК-Н-57. Потім на зміну їм прийшли ФЕК-56 і ФЕК-60. Останні два типи мають джерела випромінювання у видимій і ультрафіолетовій областях і їх правильніше назвати абсорбціометрія. На всіх ФЕК можна здійснювати також турбодиметричні вимірювання. При цьому треба мати на увазі, що турбодиметричні методи поступаються фотометрическим з тієї причини, що розсіювання або поглинання світла дисперсною фазою залежить не тільки від кількості частинок, але і від їх форми, розміру, характеру. Для підвищення стабільності суспензій застосовують стабілізатори, наприклад желатину. Стабільність суспензій - необхідна умова для того, щоб можна було правильно провести дослідження. З часу підготовки досліджуваного зразка до закінчення його вимірювання частки речовини не повинні осідати або коагулювати в помітної ступеня, що може відбитися на точності вимірювання.
Фотоколориметри, як правило, мають наступні елементи схеми: 1) осветітель- 2) светофільтри- 3) кювети- 4) фотоелементи- 5) пристрої для вимірювання або компенсації фототока.
Фотоелектроколориметри, залежно від методу вимірювання світлового потоку, діляться на два типи: а) фотоколориметри прямого отсчета- б) фотоколориметри, що працюють за методом порівняння [15].
У першому випадку вимірюється пряма залежність фотоструму від світлового потоку. У приладах цього типу застосовується один фотоелемент (або інший приймач випромінювання).
У другому випадку порівнюються з диференціальної схемою два світлових потоку - вимірювальний і компенсаційний. У приладах цього типу в залежності від схеми можуть використовуватися як один, так і два фотоелементи. Фотоколориметри з використанням диференціальної схеми є більш стабільними і точними, оскільки менше залежать від коливань напруги мережі та інших перешкод.
У фотоелектричних фотометрах застосовують різні типи фотоперетворювачів, здійснюють перетворення світла в електричний струм. В якості фотоперетворювачів застосовують фотоелементи двох різновидів - із замикаючим шаром (вентильні) і з зовнішнім фотоефектом (газонаповнені або вакуумні).
Вентильні фотоелементи не вимагають джерела живлення і можуть бути приєднані безпосередньо до вихідного приладів. Фотоелементи із зовнішнім фотоефектом в поєднанні з підсилювачем дозволяють отримати велику вихідну потужність і більший запас чутливості. До вентильним фотоелементів відносяться селенові і кремнієві.
Селеновий фотоелемент набув широкого поширення завдяки деяким своїм позитивним якостям. Інтегральна чутливість цього фотоелемента досить велика, щоб використовувати його фототок без посилення. Селенові фотоелементи мало інертні, швидко «входять в режим», мають хороші експлуатаційні якості. Такими фотоелементами оснащені фотоколориметри ФЕК-М (рис. 67).
Рис. 67. Схема селенового елемента. 1 - залізний електрод- 2 - напівпровідник з селена- 3 - металеве кільце- 4 - електрод з катодно-розпорошеного металла- 5 - гальванометр.
Суть роботи селенового фотоелемента полягає в наступному. При впливі світла електрони перескакують через замикаючий шар і потрапляють в добре провідну металеву плівку благородного металу. Струм замикається через гальванометр, залізну пластинку і повертається в напівпровідник (шар селену). Таким шляхом світлова енергія перетворюється в електричну і реєструється гальванометром. Між силою світла і фотострумом у відомих умовах дотримується строга пропорційність.
З фотоелементів із зовнішнім фотоефектом найбільш поширеними є киснево-цезієві і сурьмяно-цезієві.
Хоча фотоелементи цього типу відрізняються малою чутливістю і вимагають обов'язкового застосування підсилювальних схем, вони застосовуються в найбільш досконалих приладах завдяки чутливості до більш широкого інтервалу довжин хвиль, а також хорошим експлуатаційним якостям.
Світлофільтри із загального потоку світла пропускають лише певний інтервал довжин хвиль. Чим менше виділений світлофільтром ділянку спектра, тим виборчі фотоелектричний прилад. Існують світлофільтри скляні, металоскляний (інтерференційні), плівкові, а також рідинні. У сучасних фотоколориметрія застосовуються в основному світлофільтри з кольорового скла і інтерференційні.
Інтерференційні світлофільтри дозволяють виділяти більш вузькі ділянки спектра, при цьому часто мають більший коефіцієнт пропускання. Так, пропускання багатошарових інтерференційних світлофільтрів доходить до 90% [24], у той час як скляні для тієї ж області мають пропускання менше.
Важливими характеристиками світлофільтру є довжина хвилі в максимумі пропускання і полушіріна смуги пропускання. На рис. 68 і 69 показані ці співвідношення.
Рис. 68. Спектральні характеристики світлофільтрів.
а - шірокополосний- б - вузькосмуговий
Рис. 69. Характеристика світлофільтру (спектральна крива).
Т - коефіцієнт пропусканія-? 0,5-? - Полушіріна пропускання светофільтра-? Макс - довжина хвилі в максимумі пропусканія-? - Довжина хвилі.
Полуширина пропускання інтерференційних світлофільтрів дорівнює 10-12 нм. Інтерференційні фільтри являють собою багатошарову конструкцію зі скляних пластинок, напилених шарів металу і прошарки діелектрика. Схема інтерференційного світлофільтру наведена на рис. 70.
Рис. 70. Схема інтерференційного світлофільтра. 1 - плоскопараллельние захисні пластінкі- 2 - шар діелектріка- 3 - напівпрозорі шари срібла або алюмінію.
Колір світлофільтру відповідає тому ділянці спектру, який цим світлофільтром пропускається. Щоб візуально оцінити колір интерференционного світлофільтру, треба дивитися через кальку на добре освітлену білу папір. У табл. 9 показані рекомендовані кольору світлофільтрів для різних забарвлених розчинів.
Вибір світлофільтра для проведення кількісного дослідження виробляють згідно з такими принципами:
а) для забарвленого розчину вибирається той світлофільтр, колір якого є додатковим до кольору випробуваного розчину (див. табл. 9);
б) якщо відома спектральна область поглинання випробуваного розчину, то слід використовувати світлофільтр з максимумом пропускання, близьким до максимуму поглинання розчину. Такий підбір світлофільтру дозволяє отримати найкращу вибірковість і чутливість, а разом з тим і більшу точність.