Для вимірювання оптичної щільності і коефіцієнтів пропускання зразків в монохроматичному світлі, т. Е. В дуже вузькому інтервалі довжин хвиль, застосовуються спектрофотометри. Спектрофотометрія широко застосовується: а) для вивчення спектрів поглинання різних речовин з метою вивчення їх хімічної будови і складу-б) для кількісного визначення речовини в розчині.
У практичній діяльності лабораторій спектрофотометри найчастіше використовуються для кількісного визначення речовин за методами, заснованим на законах светопоглощения, які є загальними для фотоколориметричні і спектрофотометричних вимірювань.
Спектрофотометричні методи дозволяють вести вимірювання у вузькій області спектра - в області максимального поглинання, що збільшує чутливість і підвищує точність кількісного визначення. В результаті використання монохроматичного світла залежність поглинання світла від концентрації є більш пропорційною (прямолінійною).
Необхідно відзначити, що закон Бугера-Ламберта-Бера, строго кажучи, справедливий тільки для монохроматичного світла, т. Е. В умовах, в яких вплив заважають факторів позначається менше.
У медико-біологічних дослідженнях спектрофотометри використовуються не тільки для кількісного визначення різних компонентів в біологічних пробах, а й для стандартизації біологічно важливих речовин. Так, наприклад, кращим способом стандартизації гемоглобіну крові вважається спектрофотометрический.
Спектрофотометри використовуються при наукових дослідженнях для вивчення будови речовин, для їх ідентифікації. Для
цих цілей знімаються характеристичні спектри поглинання чистих речовин, які є індивідуальними для кожної речовини. Отримані при дослідженнях запису спектрів поглинання, при порівнянні з уже відомими, дозволяють не тільки ідентифікувати речовину, але і виявити наявність домішок, що істотно при дослідженні різних біологічних препаратів.
Тут немає можливості привести докладний список методів, що застосовуються при біохімічних дослідженнях за допомогою спектрофотометрів і мають як наукове, так і практичне (діагностичне) значення. Обмежимося перерахуванням основних груп методів визначення біологічних важливих речовин: визначення ферментів, гормонів, вітамінів, білків, азотистих речовин, нуклеїнових кислот, вуглеводів, спиртів, фенолів і кетонів, органічних кислот, ліпідів, пігментів, неорганічних речовин.
Володіючи високою чутливістю і вибірковістю, спектрофотометри дозволяють вести визначення ряду речовин у сумішах, без їхнього відділення, що значно спрощує аналіз.
Ряд продуктів азотистого обміну визначають за специфічним поглинанню в ультрафіолетовій області.
У спектрофотометрі розрізняють дві основні частини: монохроматор, що дозволяє виділяти монохроматичне світло, і фотометр, службовець для виміру поглинання або пропускання світла.
У свою чергу монохроматор складається з джерела світла, скляної - (кварцовою) призми або дифракційної решітки, що розкладають білий світ в спектр, і пристрої для регулювання спектрального інтервалу випромінюваної енергії.
Ступінь монохроматичности визначається для прецизійних спектрофотометрів величиною ± 2 нм від вибраного значення довжини хвилі і величиною ± 10 нм для більш грубих приладів.
Фотометр складається з фотоприймача (найчастіше вакуумних фотоелементів), підсилювача і компенсуючого пристрою, градуйованого в одиницях оптичної щільності і світлопропускання.
За конструктивним побудови спектрофотометри можуть бути однопроменевими і Двопроменева.
Двопроменеві спектрофотометри можуть бути з одним або з двома приймачами випромінювання, при цьому, як правило, променистий потік в них переривається (є модульованим), що забезпечує високу стабільність приладу і лінійність посилення. На рис. 76 наведена блок-схема однопроменевого спектрофотометра СФ-4 (СРСР).
Рис. 76. Блок-схема спектрофотометра СФ-4
Пояснення в тексті.
Світло від джерела випромінювання 1 проходить через вхідну щілину монохроматора 2, потрапляє на диспергирующий елемент, який розкладає випромінювання в спектр, і через вхідну щілину проходить в кюветноє відділення 3 (або у відділення подільника пучків у разі двухлучевого спектрофотометра) і далі на фотоприймач підсилювач 5 і стрілочний прилад 6.
Двопроменеві спектрофотометри конструктивно складніше однопроменевих, однак, мають ряд переваг в порівнянні з останніми. Вони дозволяють підвищити точність вимірювань за рахунок виключення впливу нестабільності джерела світла, отримати додаткову можливість реєстрації різниці спектрів двох об'єктів та ін.
Для отримання хороших результатів при роботі з спектрофотометром необхідно мати можливість перевіряти правильність установки довжин хвиль і показання оптичної щільності.
Правильність установки шкали довжин хвиль перевіряється за допомогою ртутної лампи, яка має лінійчатий спектр.
Довжини хвиль найбільш інтенсивних ліній ртутної лампи дані в посібниках до користування спектрофотометром. Для спектра ртутно-гелієвої лампи рекомендуються такі лінії: 388,9- 404,7- 435,8- 546,1- 577,0- 579,1- 587,6 і 1083 нм. Перевірку проводять візуально і фотоелектричним методом. При необхідності проводять коригування шкали поворотом дзеркального об'єктива або іншого елемента відповідно до вказівок в описі до приладу.
Правильність показань шкали оптичної щільності перевіряють за спеціальним комплекту світлофільтрів, які додаються до приладу. У паспорті до набору світлофільтрів вказано пропускання кожного з них.
На жаль, часто на перевірку правильності показань шкал довжин хвиль і оптичної щільності звертають мало уваги, а тим часом це вносить спотворення в дослідження.
Так, при вивченні деяких речовин розраховуються фактори перерахунку, молярний коефіцієнт погашення та ін. Неузгодженість шкал в різних приладах призводить до розбіжностей у підрахунку цих значень.
В повітрі приміщення, де встановлений прилад, не повинно міститися домішок парів кислот, лугів, бензину, вуглекислоти, які поглинають ультрафіолетове випромінювання (особливо в області 186-200 нм). У разі наявності цих домішок приміщення необхідно провітрювати. Іноді рекомендується при роботі в цій області спектра застосовувати продувку спектрофотометра азотом (з балона) через ротаметр. Вимірювання проводять при постійній продувці зі швидкістю 5 л / хв.
З метою правильної експлуатації приладу слід регулярно перевіряти стан осушувача в патроні осушення. Осушувач, що зберігається в склянці, в сухому стані має білий або блакитний колір, а ввібрав вологу - рожевий. Відновлення поглинальної здатності осушувача проводиться прокаливанием при 150-180 ° С протягом чотирьох-п'яти годин.