Електронна мікроскопія - це метод дослідження структур, що знаходяться поза межами видимості світлового мікроскопа і мають розміри менше одного мікрона (від 1 мк до 1-5 A).
Дія електронного мікроскопа (мал.) Засноване на використанні направленого потоку електронів, який виконує роль світлового променя в світловому мікроскопі, а роль лінз грають магніти (магнітні лінзи).
Внаслідок того, що різні ділянки досліджуваного об'єкта по-різному затримують електрони, на екрані електронного мікроскопа виходить чорно-біле зображення досліджуваного об'єкта, збільшене в десятки і сотні тисяч разів. У біології та медицині в основному використовуються електронні мікроскопи просвічує типу.
Електронна мікроскопія виникла в 30-х роках, коли були отримані перші зображення деяких вірусів (вірусу тютюнової мозаїки і бактеріофагів). В даний час електронна мікроскопія знайшла найбільш широке застосування в цитології, мікробіології і вірусології, зумовивши створення нових галузей науки. При електронній мікроскопії біологічних об'єктів застосовують спеціальні методи приготування препаратів. Це необхідно для виявлення окремих компонентів досліджуваних об'єктів (клітини, бактерії, вірусу і т. Д.), А також для збереження їх структури в умовах високого вакууму під пучком електронів. За допомогою електронної мікроскопії вивчається зовнішня форма об'єкта, молекулярна організація його поверхні, за допомогою методу ультратонких зрізів досліджується внутрішня будова об'єкта.
Електронна мікроскопія в поєднанні з біохімічними, цитохімічними методами дослідження, иммунофлюоресценцией, а також рентгеноструктурньїм аналізом дозволяють судити про склад і функції структурних елементів клітин і вірусів.
Електронний мікроскоп 70-х років минулого століття
Електронна мікроскопія - вивчення мікроскопічних об'єктів за допомогою електронного мікроскопа.
Електронний мікроскоп являє електронно-оптичний інструмент, що володіє роздільною здатністю в декілька ангстрем і дозволяє візуально вивчати тонку будову мікроскопічних структур і навіть деяких молекул.
Як джерело електронів для створення електронного пучка, що заміняє світловий пучок, служить трьохелектродна гармата, що складається з катода, керуючого електрода і анода (рис. 1).
Рис. 1. трьохелектродну гармата: 1 - катод- 2 - керуючий електрод 3 - пучок електронов- 4 - анод.
Електромагнітні лінзи, застосовувані в електронному мікроскопі замість оптичних, представляють багатошарові соленоїди, укладені в панцирі з магнітно-м'якого матеріалу, що мають на внутрішній стороні немагнітний зазор (рис. 2).
Рис. 2. Електромагнітна лінза: 1 - полюсной наконечнік- 2 - латунне кільце- 3 - обмотка- 4 - панцир.
Електричні та магнітні поля, створювані в електронному мікроскопі, є аксіально симетричними. Завдяки дії цих полів заряджені частинки (електрони), що виходять з однієї точки об'єкта в межах невеликого кута, знову збираються в площині зображення. Вся електронно-оптична система укладена в колоні електронного мікроскопа (рис. 3).
Рис. 3. Електронно-оптична система: 1 - керуючий електрод 2 - діафрагма першого конденсатора- 3 - діафрагма другого конденсатора- 4 - стігматор другого конденсатора- 5 - об'єкт-6 - лінза об'ектіва- 7 - стігматор лінзи об'ектіва- 8 - стігматор проміжної лінзи - 9 - діафрагма проекційної лінзи- 10 - катод- 11 - анод 12 - перший конденсатор- 13 - другий конденсатор- 14 - коректор фокусіровкі- 15 - столик об'ектодержателя- 16 - діафрагма лінзи об'ектіва- 17 - селекторна діафрагма- 18 - проміжна лінза - 19 - проекційна лінза- 20 - екран.
Створений електронною гарматою пучок електронів спрямовується в поле дії конденсорних лінз, які дозволяють в широких межах змінювати щільність, діаметр і апертуру пучка, що падає на досліджуваний об'єкт. У камері об'єкта встановлено столик, конструкція якого забезпечує переміщення об'єкта у взаємно перпендикулярних напрямках. При цьому можна послідовно оглянути площу, рівну 4 мм2, і вибрати найцікавіші ділянки.
За камерою об'єкта розташована лінза об'єктива, яка дозволяє досягати різкого зображення об'єкта. Вона ж дає перше збільшене зображення об'єкта, і за допомогою наступних, проміжної і проекційної, лінз загальне збільшення можна довести до максимального. Зображення об'єкта виникає на екрані, люминесцируют під дією електронів. За екраном розташовані фотопластини. Стабільність дії електронної гармати, а також чіткість зображення поряд з іншими факторами (сталість високої напруги та ін.) Багато в чому залежать від глибини розрідження в колоні електронного мікроскопа, тому якість роботи приладу в значній мірі визначається вакуумною системою (насоси, канали відкачування, крани, клапани, ущільнення) (рис. 4). Необхідне розрідження всередині колони досягається завдяки високій ефективності вакуумних насосів.
Попереднє розрідження у всій вакуумній системі створює механічний форвакуумний насос, потім вступає в дію масляний дифузійний насос-обидва насоса включені послідовно і забезпечують в колоні мікроскопа високе розрідження. Введення в систему електронного мікроскопа масляного бустерного насоса дозволило на тривалий час відключати форвакуумних насос.
Рис. 4. Вакуумна схема електронного мікроскопа: 1 - пастка, охлаждаемая рідким азотом (хладопроводов) - 2 - Високовакуумні кран- 3 - дифузійний насос-4 - обхідний клапан-5 - малий буферний баллон- 6 - бустерний насос-7 - механічний форвакуумний насос попереднього разреженія- 8 - чотирьохходовий клапанний кран-9 - великий буферний баллон- 10 - колона електронного мікроскопа- 11 - клапан напуску повітря в колону мікроскопа.
Електрична схема мікроскопа складається з джерел високої напруги, розжарення катода, харчування електромагнітних лінз, а також системи, що забезпечує змінним мережевим напругою електродвигун форвакуумного насоса, піч дифузійного насоса і освітлення пульта керування. До живильних пристроїв пред'являються дуже високі вимоги: наприклад, для високоразрешающей електронного мікроскопа ступінь нестабільності високої напруги не повинна перевищувати 5 · 10-6 за 30 сек.
Інтенсивний електронний пучок утворюється в результаті термоеміссіі. Джерелом розжарення катода, який являє собою V-подібну вольфрамову нитку, служить високочастотний генератор. Генерується напруга з частотою коливань 100-200 кГц забезпечує отримання монохроматичного електронного пучка. Харчування лінз електронного мікроскопа забезпечується постійним високостабілізірованним струмом.
Рис. 5. Електронний мікроскоп УЕМВ-100Б для дослідження живих мікроорганізмів.
Випускаються прилади (рис. 5) з гарантованою роздільною здатністю 4,5 A- на окремих унікальних знімках отримано дозвіл 1,27 A, наближається до розміру атома. Корисне збільшення при цьому одно 200000.
Електронний мікроскоп - прецезіонного прилад, який вимагає особливих методів приготування препаратів. Біологічні об'єкти малоконтрастних, тому доводиться штучно підсилювати контраст препарату. Є декілька способів підвищення контрастності препаратів. При відтінення препарату під кутом платиною, вольфрамом, вуглецем і т. Д. Стає можливим визначати на електронномікроскопічних знімках розміри по всіх трьох осях просторової системи координат. При позитивному контрастуванні препарат з'єднується з водорозчинними солями важких металів (уранілацетатом, моноокись свинцю, перманганат калію та ін.). При негативному контрастуванні препарат оточують тонким шаром аморфного речовини високої щільності, непроникного для електронів (молібденовокислий амоній, уранілацетатом, фосфорно-вольфрамова кислота та ін.).
Електронна мікроскопія вірусів (вірусоскопія) зумовила значний прогрес у вивченні ультратонкой, субмолекулярного структури вірусів (див.). Поряд з фізичними, біохімічними та генетичними методами дослідження застосування електронної мікроскопії сприяло також виникненню і розвитку молекулярної біології. Предметом вивчення цього нового розділу біології є субмікроскопічна організація і функціонування клітин людини, тварин, рослин, бактерій і мікоплазм, а також організація риккетсий і вірусів (рис. 6). Віруси, великі молекули білка і нуклеїнових кислот (РНК, ДНК), окремі фрагменти клітин (наприклад, молекулярну будову оболонки бактеріальних клітин) можна досліджувати за допомогою електронного мікроскопа після спеціальної обробки: оттенения металом, позитивного або негативного контрастування уранілацетатом або фосфорно-вольфрамової кислотою, а також іншими сполуками (рис. 7).
Рис. 6. Клітка культури тканини серця мавпи ціномольгус, інфікована вірусом натуральної віспи (X 12 000): 1 - ядро- 2 - мітохондріі- 3 - цітоплазма- 4 - вірус.
Рис. 7. Вірус грипу (негативний контрастування (Х450 000): 1 - оболочка- 2 - рибонуклеопротеид.
Методом негативного контрастування на поверхні багатьох вірусів були виявлені закономірно розташовані групи білкових молекул - капсомери (рис. 8).
Рис. 8. Фрагмент поверхні капсида вірусу герпесу. Видно окремі капсомери (X500 000): 1 - вид сбоку- 2 - вид зверху.
Рис. 9. Ультратонкий зріз бактерії Salmonella typhimurium (Х80 000): 1 - ядро- 2 - оболочка- 3 - цитоплазма.
Внутрішня будова бактерій і вірусів, а також інших більш великих біологічних об'єктів можна вивчати тільки після розсічення їх за допомогою ультратома і приготування найтонших зрізів товщиною 100-300 A. (рис. 9). Завдяки поліпшенню методів фіксації, заливки і полімеризації біологічних об'єктів, застосуванню алмазних і скляних ножів при ультратомірованіі, а також використанню висококонтрастірующіх з'єднань для фарбування серійних зрізів вдалося отримати ультратонкі зрізи не тільки великих, а й самих дрібних вірусів людини, тварин, рослин і бактерій.
- Електронна мікроскопія тканин